細胞長期保存方法解說

      細胞是生命的基本單位。（除了病毒特殊一點。）細胞由細胞核組成和細胞膜還有線粒體等組成。常見的保存還是細胞屬于活躍狀態的常溫保存或者根據細胞特性進行培養箱的溫度調整保存, 如下是做為長期保存的方法：

1、冰凍保存：冰凍保存是最常見和簡便的細胞保存方法之一。使用液氮或低溫冰箱將細胞培養物冷凍保存在-80°C或更低的溫度下。常用的冷凍液包括含有10%-20% DMSO（二甲基亞砜）的細胞保存液。

2、液氮保存：將細胞冷凍保存在液氮中，通常使用特殊的液氮保存管。液氮保存溫度為-196°C，對于長期保存非常理想。在液氮保存時，細胞最好被冰凍在含有保護劑的凍存液中。

3、高溫滅活保存：將細胞通過加熱處理使其失去生物活性，常見的方法包括烘干、滅菌和石蠟包埋。這些方法適用于某些特定類型的細胞，如細菌和酵母菌。

4、凍干保存：將細胞冷凍干燥，以保存更長的時間。將細胞培養物先冷凍至低溫，然后在真空條件下將凍結的水分直接轉化為氣體，最后封閉在密封的容器中。

一、冷凍保存方法：
1）、傳統方法:
冷存管置于4 ℃10分鐘--->-20 ℃30分鐘--->-80 ℃ 16～18小時(或隔夜)--->液氮槽vaporphase長期儲存。-20 ℃不可超過1小時，以防止胞內冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80 ℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
2）、程序降溫：
利用已設定程序的等速降溫機以-1～-3 ℃/分鐘之速度由室溫降至(-80 ℃以下)-120 ℃，再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。

二、 操作步驟：
1）、冷凍前24-48小時更換半量或全量培養基，使細胞處于指數生長期。
2）、配制冷凍保存溶液(使用前配制)：另取一離心管，加入培養基、血清，逐滴加入二甲基亞砜 (DMSO)至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置于室溫下待用。
3）、離心收集培養之細胞，用加血清的培養基重懸起細胞，取少量細胞懸浮液(約0. 1 ml)計數細胞濃度及凍前存活率。
4）、取與細胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細胞懸液，并晃動試管，制成細胞凍存懸液(DMSO后濃度為5～10%)，使細胞濃度為1～5×106cells/ ml，混合均勻，分裝于已標示完全之冷凍保存管中，1～2 ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。嚴密封口后，注明細胞名稱、代數、日期。然后進行凍存。

三、 注意事項：
1）、欲冷凍保存之細胞應在生長良好(logphase)且存活率高之狀態，約為80～90%致密度。冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。
2）、細胞在液氮中可長期凍存無限時間，而不會影響細胞活力;在-70度可保存數月。
3）、注意冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級，無菌且無色(以0. 22micron FGLP Telflon過濾或是直接購買無菌產品，如Sigma D-2650)，以5～10 ml小體積分裝，4 ℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。本方法中先制備雙倍凍存液，可避免DMSO直接加入時釋放的熱量對細胞的損傷。緩慢逐滴加入細胞懸液是使細胞逐步適應高滲，可降低細胞受損。DMSO可能引起部分白血病細胞株的分化，可換用10%甘油凍存。